交叉應(yīng)用 | 長(zhǎng)讀長(zhǎng)Isoform測(cè)序+靶向質(zhì)譜策略提供了新肽預(yù)測(cè)方法

長(zhǎng)讀長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本測(cè)序已被證明可以在單核苷酸水平上直接測(cè)定轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，并將其作為蛋白質(zhì)的前體，經(jīng)開放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)，隨后編譯成潛在的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)異構(gòu)體序列（該方法研究人員稱之為長(zhǎng)讀長(zhǎng)蛋白質(zhì)基因組學(xué)/LRP）。但受限于技術(shù)，多數(shù)在蛋白質(zhì)水平上仍未得到證明。一是異構(gòu)體往往豐度較低，缺乏獨(dú)特的定位肽，并伴隨進(jìn)化過(guò)程的突變，在剪接連接上產(chǎn)生較少的蛋白型胰蛋白酶肽段。二是技術(shù)上采用質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)基因組學(xué)，肽的采樣不是直接的，而是半隨機(jī)的，其中使用DDA或DIA模式會(huì)優(yōu)先采樣最豐富的肽質(zhì)譜分析(MS1)峰。由于參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的不完善，許多蛋白質(zhì)異構(gòu)體仍然是未知的。

最近，一項(xiàng)稱為內(nèi)標(biāo)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(internal standard parallel reaction monitoring, IS-PRM)的靶向質(zhì)譜策略已經(jīng)證明了可對(duì)感興趣的肽進(jìn)行多重且靈敏的檢測(cè)。但這種方法尚未用于確認(rèn)新肽的存在。

在“IS-PRM-based peptide targeting informed by long-read sequencing for alternative proteome detection”這項(xiàng)研究中，研究人員**展示了從蛋白質(zhì)基因組工作流程中大規(guī)模靶向檢測(cè)預(yù)測(cè)肽的方法，稱為LRP-IS-PRM。與質(zhì)譜DDA模式相比，該策略將同種異構(gòu)體的可檢測(cè)性提高了3.6倍，并鑒定出5種以前未注釋的同種異構(gòu)體，為異構(gòu)體提供了蛋白水平的證據(jù)。

結(jié)果與分析

1 基于人類細(xì)胞系建立蛋白異構(gòu)體混合物分析標(biāo)準(zhǔn)

首先，研究人員選定誘導(dǎo)多能細(xì)胞系WTC11作為復(fù)雜基質(zhì)背景下確定蛋白異構(gòu)體混合物分析標(biāo)準(zhǔn)的模型系統(tǒng)，使用細(xì)胞系進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序和MS實(shí)驗(yàn)，深入了解樣品特異性轉(zhuǎn)錄組和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)異構(gòu)體及其相關(guān)的WTC11異構(gòu)體特異性肽的選擇過(guò)程如圖1A所示。

用LRP方法(Sequel II平臺(tái))對(duì)WTC11的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了表征，并預(yù)測(cè)了異構(gòu)體水平的蛋白組(圖1A)。在WTC11樣本中，研究人員預(yù)測(cè)了來(lái)自11,755個(gè)基因的40,846個(gè)蛋白質(zhì)編碼異構(gòu)體，平均每個(gè)基因存在3.5個(gè)異構(gòu)體。并且經(jīng)SQANTI Protein評(píng)估，有24,648個(gè)(56%)蛋白質(zhì)編碼異構(gòu)體是新發(fā)現(xiàn)的。經(jīng)圖1A流程選擇的肽被命名為AS192肽，由192個(gè)肽組成，對(duì)應(yīng)55個(gè)基因，具有一個(gè)主要的異構(gòu)體和至少一個(gè)次要的異構(gòu)體。

2 Tomahto可提高異構(gòu)體特異性肽的檢出率

研究人員建立了Tomahto(一種IS-PRM)作為檢測(cè)先前觀察到的靶肽的工具后，應(yīng)用Tomahto檢測(cè)WTC11樣品中的異構(gòu)體特異性肽(內(nèi)源性AS192肽)。實(shí)驗(yàn)流程如圖1B所示：將超重型TMTpro(shTMTpro)標(biāo)記的AS192合成觸發(fā)肽加入TMTpro標(biāo)記的WTC11肽消化液中，將樣品分為不分離及高ph值下分離成8個(gè)部分兩種類型(各3個(gè)重復(fù)，圖2D)。

利用Tomahto CID對(duì)分離的WTC11樣品進(jìn)行分析，鑒定出192個(gè)AS192靶肽中的65個(gè)，是DDA HCD鑒定數(shù)目(21個(gè)肽)的3倍。另外，在未分離和分離的WTC11肽樣品中以及在不同的片段化模式下，Tomahto都返回了更高數(shù)量的確認(rèn)肽鑒定(圖3A)。WTC11中主要和次要蛋白質(zhì)同種異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示。根據(jù)定義，與主要異構(gòu)體相比，次要異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄物豐度較低，理論上分析鑒定更具挑戰(zhàn)性。值得注意的是，研究人員通過(guò)MS2采集掃描檢測(cè)觸發(fā)肽(而非MS1信號(hào))檢測(cè)到一種內(nèi)源性的異構(gòu)體特異性肽(缺乏MS1信號(hào))：EQPGSYSDAPEYLWSGTL(見圖3B箭頭)。觸發(fā)點(diǎn)和靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的MS1譜圖和MS2碎片圖如圖3C所示，這增加了檢測(cè)低豐度肽的靈敏度，這對(duì)于檢測(cè)低豐度次要異構(gòu)體至關(guān)重要。

3 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序提供了對(duì)蛋白質(zhì)異構(gòu)體表達(dá)的深入了解

為了標(biāo)注檢測(cè)到的肽支持的異構(gòu)體，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)UCSC基因組瀏覽器track63來(lái)可視化RNA轉(zhuǎn)錄本、它們的預(yù)測(cè)蛋白和相關(guān)的異構(gòu)體特異性肽，提供多肽鑒定的基因組和可變剪接背景(圖4)。值得注意的是，研究人員捕獲了與AP1S2、ARFIP1、CIRBP、ASB6、CHTF8、LTA4H、NUP50、FBXL15、SF3B1和FBXO44基因?qū)?yīng)的主要和次要異構(gòu)體特異性肽對(duì)(表1)。除ARFIP1和AP1S2外，所有主要和次要異構(gòu)體對(duì)都是僅可經(jīng)Tomahto鑒定。特別的是，從基因SF3B1中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼剪接體核心復(fù)合體的**亞基的異構(gòu)體，介導(dǎo)選擇性剪接(圖4B)。SF3B1突變發(fā)生在惡性腫瘤中與不良患者預(yù)后相關(guān)，因此SF3B1突變蛋白可能作為患者的生物標(biāo)志物，這使得檢測(cè)SF3B1的特異性異構(gòu)體十分重要。綜上，通過(guò)使用Tomahto等方法，研究人員可以確認(rèn)在病理或生理狀態(tài)下剪接變化引起的穩(wěn)定表達(dá)的同種異構(gòu)體。

此外，研究人員從以前未注釋的異構(gòu)體中檢測(cè)到5個(gè)肽，定義為在WTC11蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)，但在GENCODE v42參考蛋白質(zhì)組中未注釋(表1)。其中，C1orf52是一個(gè)未被充分研究的蛋白質(zhì)編碼基因，其變異與多發(fā)性硬化癥的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(圖4C)。C1orf52已被確定為一種RNA結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，這些蛋白的突變與許多疾病有關(guān)。

最后，研究人員評(píng)估了質(zhì)譜檢測(cè)AS192目標(biāo)肽的能力，研究人員交叉檢查了UCSD MassIVE (https://massive.ucsd.edu)和PeptideAtlas68質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以尋找在之前的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察到AS192肽的證據(jù)。共有141個(gè)AS192多肽有先前MS觀察的證據(jù)，而51個(gè)在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中缺失(表2)。研究人員檢測(cè)到8種以前未檢測(cè)到的肽，包括來(lái)自SF3B1的次要異構(gòu)體特異性肽(表1)。檢測(cè)到以前未注釋的異構(gòu)體和肽，這些未在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道，突出了將長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序信息預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)與靶向質(zhì)譜相結(jié)合的能力。

討論與展望

通過(guò)將長(zhǎng)讀長(zhǎng)蛋白質(zhì)基因組學(xué)與內(nèi)標(biāo)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(LRP-IS-PRM)相結(jié)合，研究人員可以系統(tǒng)地探索不同條件下的可變蛋白質(zhì)組。例如，廣泛存在于從細(xì)胞分化到癌癥的各種生理和病理狀態(tài)中的異構(gòu)體轉(zhuǎn)換。通過(guò)利用LRP-IS-PRM，這些差異剪接事件可以在更大范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體水平上進(jìn)行量化。這項(xiàng)研究**成功地將蛋白質(zhì)基因組學(xué)方法與基于觸發(fā)器的肽靶向軟件Tomahto結(jié)合起來(lái)以表征可變蛋白質(zhì)組。

PacBio HiFi測(cè)序系統(tǒng)

HiFi測(cè)序讀長(zhǎng)能達(dá)到10-25 kb，準(zhǔn)確度也在Q30（99.9%）以上，Iso-seq方法可提供全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體，無(wú)需組裝即可表征轉(zhuǎn)錄組的完整多樣性，探索不同剪接機(jī)制生成的不同異構(gòu)體是如何導(dǎo)致健康和疾病間的表型差異：

ü 發(fā)現(xiàn)可變起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，檢測(cè)可變多聚腺苷化

ü 揭示復(fù)雜可變剪接、融合事件以及轉(zhuǎn)錄通讀

ü 鑒定等位基因特異性異構(gòu)體

PacBio推出了Kinnex試劑盒！??！

Kinnex試劑盒基于MAS-Seq方法，可將較小的DNA片段連接成較長(zhǎng)的HiFi可用文庫(kù)，提高測(cè)序通量，使長(zhǎng)讀長(zhǎng) RNA -seq更具成本效益。

Kinnex 單細(xì)胞RNA試劑盒以現(xiàn)有的 MAS-Seq for Single Cell 3'試劑盒為基礎(chǔ)，增加了對(duì) 10x Genomics 5'試劑盒和文庫(kù)復(fù)用的額外支持?？墒箿y(cè)序通量提高16倍，獲得基因表達(dá)及全長(zhǎng)isoform信息，在單細(xì)胞水平上揭示RNA異構(gòu)體多樣性。

ü Kinnex 全長(zhǎng)RNA試劑盒可進(jìn)行全長(zhǎng)RNA 測(cè)序，與典型的Iso-seq文庫(kù)相比，其通量提高了8倍，可實(shí)現(xiàn)從5'端到3'端全長(zhǎng)異構(gòu)體測(cè)序，準(zhǔn)確表征剪接位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新基因和新異構(gòu)體，鑒定融合基因，并獲得基因及異構(gòu)體read計(jì)數(shù)信息進(jìn)而分析表達(dá)量。

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