PCR實(shí)驗(yàn)中DNA/RNA污染怎么辦

在PCR實(shí)驗(yàn)中，DNA/RNA污染是一個(gè)常見(jiàn)且嚴(yán)重的問(wèn)題，它可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性或誤差。以下是一些針對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)中DNA/RNA污染的處理措施：

一、污染源分析

首先，需要明確污染源。PCR實(shí)驗(yàn)中的DNA/RNA污染可能來(lái)自多個(gè)方面，包括但不限于：

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染：PCR產(chǎn)物經(jīng)反復(fù)多次的擴(kuò)增，其復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)PCR的檢測(cè)極限，所以即使是極微量的污染也足以造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性。

試劑的污染：在試劑的配制過(guò)程中，可能因接觸污染的容器、移液器、槍頭、溶液等而導(dǎo)致試劑被污染。

待測(cè)樣品的污染：放置樣品的容器被污染，或由于容器密封不嚴(yán)導(dǎo)致樣品與外界接觸被污染；在核酸提取過(guò)程中使用了被污染的移液器或槍頭；某些樣品中含有病毒，若彌散到空氣中則有可能形成交叉污染。

氣溶膠污染：氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產(chǎn)生的，開(kāi)蓋、晃動(dòng)反應(yīng)管及污染加樣器的反復(fù)吸樣都可能形成氣溶膠，從而導(dǎo)致交叉污染。

二、預(yù)防措施

為預(yù)防DNA/RNA污染，應(yīng)采取以下措施：

設(shè)置陰性對(duì)照：設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對(duì)照反應(yīng)，以監(jiān)測(cè)污染情況，判斷污染原因，并采取措施防止和消除污染。

實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：按照相關(guān)規(guī)定對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分區(qū)，確保工作和空氣流向嚴(yán)格遵循試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→PCR擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)的順序。

提高規(guī)范操作意識(shí)：定期組織全員進(jìn)行防污染安全培訓(xùn)，宣講PCR實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范，并印發(fā)相關(guān)文件供學(xué)習(xí)。

常規(guī)操作清潔：在樣本處理前后，使用專門的PCR污染清除劑，比如：PCR-Clean?，清潔設(shè)備、耗材、操作臺(tái)等。

三、處理措施

一旦PCR實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)DNA/RNA污染，應(yīng)采取以下處理措施：

重點(diǎn)清潔：對(duì)重點(diǎn)區(qū)域、核酸提取儀、PCR儀、離心機(jī)等關(guān)鍵設(shè)備進(jìn)行清潔操作，確保氣溶膠污染沒(méi)有累積。

月度清潔：有計(jì)劃地進(jìn)行月度大清理，使用PCR污染清除劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的大面積區(qū)域進(jìn)行清除DNA/RNA氣溶膠污染物的操作。

紫外照射：每天工作完畢后，開(kāi)啟紫外燈照射工作區(qū)一定時(shí)間（如30分鐘），以殺滅可能存在的微生物和降解DNA/RNA污染。在提取核酸后，應(yīng)將紫外線照射時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。

更換試劑和耗材：如懷疑試劑或耗材被污染，應(yīng)立即更換新的試劑和耗材，如引物、酶、去離子水和EP管等。

更換PCR擴(kuò)增區(qū)域：如污染嚴(yán)重，可考慮更換PCR擴(kuò)增區(qū)域，以避免交叉污染。

四、監(jiān)控與應(yīng)急處理

污染監(jiān)控：安排質(zhì)控員記錄陽(yáng)性率及假陽(yáng)性的發(fā)生頻率，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常。同時(shí)采集環(huán)境中的樣本進(jìn)行核酸污染分析，以便盡早發(fā)現(xiàn)污染源并盡快清除污染。

應(yīng)急處理：如PCR實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)陽(yáng)性率異常升高、空白對(duì)照/陰參頻繁出現(xiàn)假陽(yáng)性或發(fā)現(xiàn)未知擴(kuò)增條帶重復(fù)出現(xiàn)等情況，應(yīng)立即使用PCR污染清除劑進(jìn)行緊急污染源的排除和清理。

綜上所述，PCR實(shí)驗(yàn)中的DNA/RNA污染需要采取綜合措施進(jìn)行預(yù)防和處理。通過(guò)明確污染源、采取預(yù)防措施、及時(shí)處理污染以及加強(qiáng)監(jiān)控與應(yīng)急處理等措施，可以確保PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。