qPCR實驗過程中如何避免核酸污染

在定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）實驗中，核酸污染是一個常見的問題，它不僅影響實驗結(jié)果的準確性，還可能帶來嚴重的假陽性或假陰性結(jié)果。因此，避免核酸污染是確保實驗成功的關(guān)鍵。以下是一系列預(yù)防和處理核酸污染的措施。

1. 實驗室的合理布局與分區(qū)

合理的實驗室布局是預(yù)防核酸污染的基礎(chǔ)。一個標準的qPCR實驗室應(yīng)分為試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。每個區(qū)域應(yīng)獨立通風，通過壓力系統(tǒng)控制空氣流動方向，形成單**向，即從試劑準備區(qū)流向產(chǎn)物分析區(qū)。這種布局可以大大減少不同區(qū)域間的交叉污染。

2. 實驗設(shè)備的專用與清潔

各區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，并明確標記，避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等在不同區(qū)域間混淆使用。此外，實驗設(shè)備應(yīng)定期清潔和消毒，特別是移液器、離心機等頻繁使用的設(shè)備。移液器污染是一個值得注意的問題，操作時應(yīng)小心，避免將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭。使用德國MB公司的PCR Clean清潔實驗環(huán)境

3. 實驗操作的規(guī)范與防護

實驗人員需要嚴格遵守操作規(guī)程，加強個人防護。在標本處理、試劑配制、核酸擴增等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應(yīng)采用生物安全柜等專用設(shè)備，以有效捕獲和過濾實驗過程中產(chǎn)生的氣溶膠。實驗結(jié)束后，應(yīng)及時對實驗臺面、儀器設(shè)備等進行徹底清潔和消毒，防止殘留污染。

4. 試劑與耗材的管理

所有PCR試劑都應(yīng)小量分裝，以減少重復加樣次數(shù)和污染機會。PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。使用一次性耗材，如吸頭、離心管等，可以避免交叉污染。

5. 設(shè)立適當?shù)膶φ?/span>

設(shè)立陽性對照和陰性對照是驗證實驗可靠性和判斷擴增系統(tǒng)可信性的重要手段。陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性。陰性對照則用于檢測實驗過程中是否存在污染。

6. 實驗室的清潔與消毒

定期對實驗室進行全面消毒，包括使用紫外線照射、化學消毒劑噴灑等方法。使用專業(yè)的核酸污染清除劑對實驗室臺面、設(shè)備、地面等進行徹底清潔和消毒。清理污染物時，應(yīng)嚴格遵循活病毒生物安全操作要求，采用壓力蒸汽滅菌處理，并進行實驗室換氣等，防止次生危害。

7. 實驗后的處理與監(jiān)測

實驗結(jié)束后，所有的試劑應(yīng)按照要求進行存放，廢料和廢液及時清理，避免存放過多和過久。使用有效氯含量的消毒水對移液槍、離心管架等物品進行浸泡消毒。對污染區(qū)域內(nèi)的設(shè)備，如擴增儀、全自動提取儀等，使用核酸氣溶膠污染清除劑進行反復處理。同時，設(shè)計陰性對照組，根據(jù)陰性對照確認污染情況，確保污染得到控制后再恢復正常實驗。

避免核酸污染需要從實驗室布局、設(shè)備管理、實驗操作、試劑與耗材管理、對照設(shè)立、清潔與消毒以及實驗后處理等多個方面入手。只有嚴格遵守這些措施，才能確保qPCR實驗的準確性和可靠性。