細胞培養(yǎng)中的污染監(jiān)控與檢測——細菌

一、細菌污染

細菌概述

細菌是一種原核細胞微生物，一般為微米級別。細胞培養(yǎng)過程中常見的污染菌為大腸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等。

細菌污染癥狀

與其他污染相比，細菌污染在細胞培養(yǎng)過程中“發(fā)病”更為迅速，較容易被發(fā)現(xiàn)。具體表現(xiàn)為：

• 細胞培養(yǎng)基短期內(nèi)變黃且渾濁（大量酸性物質(zhì)累積）

• 靜置的培養(yǎng)液時不渾濁，但稍加震蕩，就有許多渾濁物漂起

• 可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮

• 細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)，后出現(xiàn)大量死亡

細菌污染鑒定

簡易方法：

1、取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查，憑經(jīng)驗判斷細菌種類。

2、向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)滴入少量培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)以檢測。

專業(yè)試劑盒檢測。以Minerva Biolabs公司的細菌PCR檢測試劑盒為例（點擊下方圖片直達微信商城，了解更多詳情）：

該試劑盒采用PCR方法，用于檢測生物樣品（包括細胞培養(yǎng)物和病毒貯存液）中是否存在細菌。根據(jù)序列分析，該試劑盒可檢測超過45種細菌屬，其中含污染細胞的常見菌屬：

試劑盒包括

凍干混合物：含引物/核苷酸/內(nèi)部擴增對照DNA /聚合酶

復溶緩沖液

凍干的陽性對照DNA

PCR級水

樣本處理

樣本不用提DNA，只需熱滅活（95 °C 5分鐘）。樣本需不含抗生素。如含抗生素，則細胞應在不含抗生素的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)至少一代。

保質(zhì)期

2-8℃可保存至少6個月。

凍干試劑溶解后，需在-18℃以下保存。

結(jié)果分析：

內(nèi)控對照顯示PCR反應正常，樣本中無PCR抑制成分。460bp左右存在目的條帶，提示存在細菌污染。

細菌污染的祛除

對于一般細胞：發(fā)生污染直接丟棄，并對環(huán)境進行消殺，紫外線滅菌、消毒液擦拭培養(yǎng)箱、工作臺等。

對于重要且污染相對較輕的細胞：一般用抗生素的常用量的 5~10 倍作沖擊療法，用藥 24~48 小時后再換常規(guī)培養(yǎng)液，需要注意的是：

一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以根除，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應。

且有研究表明，大量使用抗生素，或?qū)毎蚪M產(chǎn)生影響。

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