支原體標(biāo)準(zhǔn)品在核酸法驗(yàn)證中的應(yīng)用

支原體核酸法是通過(guò)檢測(cè)支原體的特異核酸序列，以確定細(xì)胞上清或生物制品中是否存在支原體污染的一種方法。由于它具有檢測(cè)時(shí)間短（只需3-4h）、操作便捷等特點(diǎn)，越來(lái)越受到生物制品企業(yè)的青睞。

支原體核酸法包括PCR和qPCR，可作為藥典規(guī)定的培養(yǎng)法或DNA染色法的替代方法，或與以上方法相互補(bǔ)充。事實(shí)上，早在2011年，就有動(dòng)物疫苗廠家在2011年第5期的《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)》上，報(bào)道了用德國(guó)Minerva Biolabs（簡(jiǎn)稱MB）公司的支原體PCR試劑盒，用于檢測(cè)疫苗中是否存在支原體的污染，它可與培養(yǎng)法互為補(bǔ)充，共同用于生產(chǎn)，為生產(chǎn)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

但支原體核酸法在用于放行檢測(cè)之前，需先進(jìn)行方法驗(yàn)證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個(gè)指標(biāo)方面達(dá)到要求。

例如，在靈敏度方面（又稱最低檢測(cè)限），要求核酸法替代培養(yǎng)法，則靈敏度需達(dá)到10CFU/ml；核酸法替代DNA染色法，則靈敏度需達(dá)到100CFU/ml。

在特異性方面，歐洲藥典和日本藥典要求，核酸法要識(shí)別指定的常見(jiàn)9種支原體，而不識(shí)別與支原體有近緣關(guān)系的菌屬，如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌，也不識(shí)別其他細(xì)菌和哺乳動(dòng)物DNA。

在耐用性方面，歐洲藥典要求檢測(cè)結(jié)果不受方法參數(shù)的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細(xì)微差別等。實(shí)際上這是強(qiáng)調(diào)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，不受人為操作誤差的影響。這可通過(guò)3輪不同時(shí)間段內(nèi)的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)，每輪進(jìn)行8次重復(fù)檢測(cè)，最后觀察結(jié)果有什么變化。

在進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)，參比標(biāo)準(zhǔn)品是必不可少的。世界**微生物防控專(zhuān)家德國(guó)MB公司提供有一系列的支原體標(biāo)準(zhǔn)品和支原體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用于支原體核酸法的方法學(xué)驗(yàn)證。

圖. MB公司提供的10CFUTM支原體套裝

MB提供的標(biāo)準(zhǔn)品有三類(lèi)：一類(lèi)是靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它同時(shí)也用于耐用性驗(yàn)證。該標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉型的滅活支原體，這樣不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室污染。原支原體來(lái)自英國(guó)NCTC菌種保藏中心，由于傳代次數(shù)低，也很少發(fā)生突變。支原體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)定量，有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時(shí)用1ml與待測(cè)樣本同樣的基質(zhì)液去溶解。之后進(jìn)行支原體DNA抽提，再進(jìn)行核酸法檢測(cè)。如結(jié)果陽(yáng)性，則表明最低檢測(cè)限能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

MB公司第二類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品為特異性驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品，它包括支原體基因組DNA以及細(xì)菌基因組DNA，種屬經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。該標(biāo)準(zhǔn)品為10ng左右包裝，為凍干粉型。

第三類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格定量的支原體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，每管支原體基因組DNA的量為1×108基因組拷貝，用于10倍梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)核酸法（主要是qPCR）的檢測(cè)限進(jìn)行精確定量，并可驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)與Ct值的線性關(guān)系。

圖. 肺炎支原體DNA的定量。模板DNA的范圍為2X105-2個(gè)拷貝數(shù)基因組

值得指出的是，歐洲藥典和日本藥典均要求先進(jìn)行支原體DNA抽提，再進(jìn)行核酸法檢測(cè)。因此，方法驗(yàn)證實(shí)際上包括了核酸法的這兩部分。

對(duì)于生物制品、細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)，在選用已經(jīng)過(guò)廠家全面驗(yàn)證的支原體檢測(cè)試劑盒之外，還需自己按照待測(cè)樣本類(lèi)型進(jìn)行方法的適用性驗(yàn)證。因?yàn)樵噭┖械尿?yàn)證并不能代替包括操作過(guò)程在內(nèi)的方法的適用性，操作、樣本基質(zhì)和儀器同樣會(huì)對(duì)核酸法的技術(shù)指標(biāo)產(chǎn)生不可忽視的影響。

如您對(duì)德國(guó)MB公司的支原體標(biāo)準(zhǔn)品或檢測(cè)試劑盒感興趣，歡迎聯(lián)系MB公司中國(guó)區(qū)總代理上海威正翔禹生物或北京締一生物科技有限公司。

具體信息如下：

北京締一生物網(wǎng)址：www.dyshengwu.com

上海威正翔禹網(wǎng)址：m.jilebo.com

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郵箱：servicesh@viansaga.com

德國(guó)MB公司簡(jiǎn)介：

德國(guó)MB公司，全稱Minerva Biolabs，是世界**的微生物污染控制公司，成立于1999年，總部位于德國(guó)柏林。MB公司具有ISO 9001和ISO 13485體系認(rèn)證。

公司創(chuàng)始人來(lái)自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。

二十年來(lái)，MB公司專(zhuān)注于微生物污染檢測(cè)與清除，

特別是支原體和軍團(tuán)菌的技術(shù)和產(chǎn)品，在世界上遙遙領(lǐng)先。

?自1999年起即研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)和生物藥工業(yè)用QC檢測(cè)試劑

?配備生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室

?GMP級(jí)潔凈車(chē)間生產(chǎn)

?世界**的支原體PCR檢測(cè)試劑供應(yīng)商

?IOM和PDA成員

?ISO 9001和ISO 13485認(rèn)證

注：IOM全稱Institute of Medicine

PDA全稱Parenteral Drug Association

2007年，上海威正翔禹生物科技有限公司作為MB公司的全國(guó)總代理，將支原體檢測(cè)防控的優(yōu)秀產(chǎn)品引入中國(guó)。十幾年來(lái)，不斷為中國(guó)生物研究實(shí)驗(yàn)室，以及眾多生物制藥企業(yè)，提供了完整高效的支原體等微生物檢測(cè)及祛除解決方案。