新型CRISPR工具或能通過(guò)將RNA復(fù)制到基因組中精確修飾基因

構(gòu)成生命藍(lán)圖的DNA序列變異對(duì)任何物種的健康都是至關(guān)重要的，成千上萬(wàn)的DNA突變被認(rèn)為都會(huì)導(dǎo)致疾病，經(jīng)過(guò)幾十年的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究后，如今研究人員在開發(fā)能夠糾正突變的基因組編輯工具上取得了巨大的進(jìn)展，但由于工具依賴于復(fù)雜和相互競(jìng)爭(zhēng)的細(xì)胞過(guò)程，基因編輯的效率和準(zhǔn)確性似乎受到了根本性的限制；近日，一項(xiàng)刊登在國(guó)際雜志Nature上的研究報(bào)告中，研究者Anzalone等人描述了一種“查找并替換”（search-and-replace）的基因組編輯技術(shù)，即將兩種分子機(jī)器相結(jié)合來(lái)精確改變基因組，該技術(shù)對(duì)于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究具有直接且深遠(yuǎn)的影響。

人類對(duì)基因組進(jìn)行改造的努力早于對(duì)基因乃至遺傳起源的了解，**個(gè)基因組工程依靠自然變異和通過(guò)選擇性繁殖的人工選擇。比如，現(xiàn)代玉米就是通過(guò)9000多年前的人工選擇，從其野生型祖先-大芻草(Teosinte，墨西哥玉米)進(jìn)化而來(lái)；后來(lái)人們意識(shí)到DNA序列會(huì)影響生命，同時(shí)還能利用誘變劑（比如輻射或化學(xué)藥物）來(lái)增強(qiáng)和加速人工進(jìn)化，這就推動(dòng)了后代的發(fā)展。

接下來(lái)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，修復(fù)DNA序列錯(cuò)誤的細(xì)胞過(guò)程可能會(huì)被劫持，其能允許來(lái)自外源性模板的DNA序列在DNA斷裂時(shí)插入到基因組中，如果DNA被故意破壞，這個(gè)過(guò)程就會(huì)被大大加強(qiáng)，這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了科學(xué)家們20多年來(lái)對(duì)一種酶類的研究，這種酶類可以在科學(xué)家們感興趣的任意位點(diǎn)來(lái)切割DNA，最終研究人員采用了細(xì)菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其中Cas9酶類能夠利用一種定制化的RNA向?qū)?lái)在人類細(xì)胞中尋找DNA序列并進(jìn)行切割。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠幫助所有研究人員對(duì)基因組進(jìn)行編輯，這引發(fā)了生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，然而最終其也僅僅是一把能夠切割DNA的分子剪刀，由于對(duì)DNA的切割對(duì)細(xì)胞會(huì)帶來(lái)致命性的作用，因此必須通過(guò)許多獨(dú)立途徑中的一種對(duì)其進(jìn)行緊急修復(fù)；在基因組編輯的背景下，研究者所想得到的結(jié)果常常是通過(guò)DNA來(lái)指導(dǎo)修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)更加精確地編輯，但大多數(shù)細(xì)胞更喜歡利用另一種機(jī)制，在這種機(jī)制中，DNA模板會(huì)被忽略，而DNA的兩個(gè)斷裂末端并不會(huì)被完美地縫合在一起，這或許就是基因組編輯的主要限制。

過(guò)去幾年，研究人員重點(diǎn)集中在將不完美的平衡轉(zhuǎn)化為精確的基因編輯，其中一種有效的策略就是對(duì)DNA進(jìn)行編輯而不切斷雙螺旋中的兩條DNA鏈，雙鏈的斷裂時(shí)導(dǎo)致不完美編輯的主要原因，在這方面的一個(gè)里程碑就是對(duì)堿基編輯的發(fā)展，在該過(guò)程中，只切割一條DNA鏈的Cas9酶能與另一種酶類相結(jié)合，然而，堿基編輯的技術(shù)限制及需要修改的不僅僅是單個(gè)DNA堿基，意味著科學(xué)家們?nèi)匀黄惹行枰_發(fā)出新型的基因編輯方法。

為此，研究者Anzalone等人開發(fā)出了一種名為prime編輯(prime editing)的新型基因編輯技術(shù)，該技術(shù)依賴于一種混合分子機(jī)器，其包括一個(gè)改良版本的Cas9，其金輝切割兩條DNA鏈中的一條，和一個(gè)轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí)會(huì)在切割位點(diǎn)安裝新的和可定制的DNA；這種組合與酵母中自然發(fā)生的過(guò)程非常相似，在酵母中，與RNA序列相對(duì)應(yīng)的DNA會(huì)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶整合到基因組中去。

prime編輯能被一種工程化、兩部分組成的RNA向?qū)нM(jìn)行調(diào)節(jié)，向?qū)е械摹皩ふ摇辈糠謺?huì)指導(dǎo)Cas9進(jìn)入到DNA靶點(diǎn)的特殊序列，從而對(duì)其中一條DNA鏈進(jìn)行切割，隨后，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在RNA向?qū)У奶鎿Q部位產(chǎn)生與該序列互補(bǔ)的DNA，并將其安裝在被切割的其中一個(gè)DNA末端處，從而取代原來(lái)的DNA序列。

此時(shí)，被修飾的雙鏈DNA會(huì)由兩條不互補(bǔ)的鏈組成，即被編輯過(guò)的鏈和未被Cas9切斷的完整鏈，非互補(bǔ)序列在細(xì)胞中是不被容忍的，其中一個(gè)鏈必須通過(guò)DNA的修復(fù)過(guò)程來(lái)固定從而匹配另外一個(gè)鏈，而完整的鏈則通常會(huì)被優(yōu)先保留；因此作者通常必須使用第二種RNA向?qū)?lái)指導(dǎo)對(duì)完整鏈的切割，從而增加修復(fù)該鏈以匹配編輯序列的機(jī)會(huì)；研究者通過(guò)高效精確地將大量序列引入到DNA中，從而展示了prime編輯的多功能性，比如，研究人員在人類胚胎腎細(xì)胞中使用該技術(shù)來(lái)糾正產(chǎn)生血液鐮刀細(xì)胞病的突變，同時(shí)還能對(duì)引發(fā)神經(jīng)性Tay-Sachs病的突變進(jìn)行編輯，這幾乎完全避免了不完美的編輯，同時(shí)研究者還在體外對(duì)人類癌細(xì)胞和小鼠神經(jīng)元進(jìn)行了編輯。

幾十年來(lái)，基因組編輯的潛力一直受到難以進(jìn)行精確修改的限制，因此很多技術(shù)主要集中在不完美的DNA編輯有用的情況下，這種基因編輯能用來(lái)破壞基因的功能，并未理解其功能提供了一定的途徑；如今prime編輯技術(shù)能夠更快更容易地建立或糾正多個(gè)特定的突變，與此前相比，其能夠?qū)Ω囝愋偷募?xì)胞進(jìn)行操作。

盡管如此，prime編輯技術(shù)也尤其局限性，發(fā)生在prime編輯組分之間的復(fù)雜、多步分子“舞蹈”還無(wú)法被預(yù)測(cè)，而且其并不總是會(huì)如預(yù)期那樣出現(xiàn)；因此仍然可能出現(xiàn)不完全的隨機(jī)編輯，這意味著研究人員可能需要測(cè)試幾個(gè)組分的不同組合，從而確定每個(gè)感興趣編輯所需要的編排方式；其次，將大型的prime編輯系統(tǒng)引入到特定的細(xì)胞類型中非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橹霸S多嘗試都在Cas9系統(tǒng)中失敗了。

基于這樣的研究目的，這些限制或許是不方便的，后期研究人員還會(huì)進(jìn)行更為深入的研究對(duì)其進(jìn)行克服，并更好地理解和調(diào)整當(dāng)前方法；但是，對(duì)于醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，這些問(wèn)題提出了很大的挑戰(zhàn)，即不完美的DNA編輯是不可接受的，且將prime編輯系統(tǒng)引有效引入到細(xì)胞中將會(huì)至關(guān)重要；因此，盡管prime編輯能對(duì)生命的藍(lán)圖進(jìn)行空前地控制，但只有時(shí)間才能夠證明其是CRISPR工具箱中另一種治療遺傳性疾病的萬(wàn)能藥物。