顯色培養(yǎng)基的發(fā)展十年

（—）介紹

過(guò)去25年，顯色培養(yǎng)基在臨床獲得了廣泛的應(yīng)用。過(guò)去10年，顯色培養(yǎng)基的檢測(cè)范圍不斷擴(kuò)大，已包括銅綠假單胞菌、B族鏈球菌、艱難梭菌、彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及一些耐藥菌等。

顯色培養(yǎng)基檢測(cè)目標(biāo)菌，是基于它們的酶活性。然而，這些酶活性并非100%菌種特異性的，因此還需使用酶底物作為代謝物以及選用選擇因子。

大部分的顯色培養(yǎng)基同時(shí)有選擇和鑒別功能，能抑制無(wú)關(guān)菌群。它使得目標(biāo)菌產(chǎn)生特別顏色，從而減少了待檢菌的數(shù)量。它減少了勞動(dòng)量，減少了試劑的使用，所需使用的生化試劑和血清學(xué)試劑更少。它能快速確證病原菌，減少了出報(bào)告的總花費(fèi)時(shí)間。因?yàn)橹虏【鋷в蓄伾容^顯著，而不會(huì)被漏檢，因而改善了的檢出率。

（二）病原菌的檢測(cè)

臨床用于致病菌檢測(cè)的顯色培養(yǎng)基已有不少種，和傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基需要更少的驗(yàn)證試驗(yàn)，尤其對(duì)于那些近似目標(biāo)菌的伴生菌。顯色培養(yǎng)基的鑒別能力還體現(xiàn)在念珠菌顯色培養(yǎng)基上。和傳統(tǒng)的沙氏氯霉素平板相比，念珠菌顯色瓊脂可以鑒別不同種的念珠菌，而且還有助于耐藥念珠菌的檢測(cè)。

志賀菌產(chǎn)生的酶較少，因而限制了顯色培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)。然而，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)所有志賀菌物種都合成β-核糖苷酶（ribosidase），可作為顯色培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）受到臨床的重視。但一些STEC的血清型菌種發(fā)酵山梨醇，因而限制了山梨醇麥康凱瓊脂的臨床應(yīng)用。

從糞便中分離小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，常用CIN瓊脂，它是基于該致病菌以甘露醇發(fā)酵為基礎(chǔ)。但CIN瓊脂的局限是，一些其他腸桿菌科也能生長(zhǎng)和發(fā)酵甘露醇。而顯色培養(yǎng)基則能提高特異性。

圖.HiMedia的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌顯色培養(yǎng)基，貨號(hào)M2025（需添加劑FD034）

不動(dòng)桿菌，尤其是鮑曼不動(dòng)桿菌，是重要的院內(nèi)病原體。對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素有耐藥性的不動(dòng)桿菌已引起了廣泛關(guān)注，因?yàn)檫@些耐藥菌非常難以治療。曾有人評(píng)估不動(dòng)桿菌顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性分別為91.7％和89.6％。

圖.HiMedia不動(dòng)桿菌顯色培養(yǎng)基，貨號(hào)M1938（需添加劑FD271）

（三）實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化對(duì)顯色培養(yǎng)基應(yīng)用的影響

過(guò)去10年，臨床實(shí)驗(yàn)室的顯著變化是引入了MALDI-TOF質(zhì)譜用于快速準(zhǔn)確的鑒定微生物物種。但對(duì)于診斷來(lái)說(shuō)，先行培養(yǎng)仍然是大部分MALDI-TOF的先決條件。MALDI-TOF只是顯色培養(yǎng)基的輔助手段。由于沒(méi)有哪個(gè)顯色培養(yǎng)基能保證絕對(duì)的特異性，因而需要進(jìn)一步的菌種鑒定。

MALDI-TOF的主要好處是將病原菌的鑒定時(shí)間減少到1個(gè)小時(shí)以內(nèi)，并降低了鑒定的成本。MALDI-TOF質(zhì)譜能彌補(bǔ)一些培養(yǎng)基特異性缺乏的問(wèn)題，但不能解決培養(yǎng)基靈敏度的問(wèn)題。

實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化涵蓋了樣本的平板接種、菌落自動(dòng)計(jì)數(shù)和分析。數(shù)字自動(dòng)成像軟件可以觀察到菌落顏色像素的差異。顯色培養(yǎng)基特別適合數(shù)字自動(dòng)化。可以在軟件上設(shè)定顏色閾限，以區(qū)分出目標(biāo)菌。其他有好幾項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，數(shù)字成像可以彌補(bǔ)一開(kāi)始人為讀數(shù)的漏檢。

（四）顯色培養(yǎng)基和分子診斷方法的比較

PCR、生物芯片和全基因組測(cè)序在臨床診斷實(shí)驗(yàn)室已獲得了應(yīng)用。它們和傳統(tǒng)培養(yǎng)法一起，同樣存在方法上的利弊。**個(gè)考慮因素是靈敏度。有研究發(fā)現(xiàn)，PCR和顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法對(duì)于篩查艱難梭菌和萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌具有

同等的靈敏度。然而，艱難梭菌培養(yǎng)后還需對(duì)毒素基因進(jìn)行證實(shí)，而PCR的好處是一次即可同時(shí)完成。對(duì)于無(wú)乳鏈球菌，有報(bào)道說(shuō)PCR法比顯色培養(yǎng)基法更靈敏，但在肉湯增菌后，兩種方法的靈敏度則沒(méi)有區(qū)別。另有研究顯示，對(duì)于MRSA的檢測(cè)，如果有增菌這一步或者孵育時(shí)間達(dá)到48h，顯色培養(yǎng)基的靈敏度是不亞于PCR的。

對(duì)于胃腸炎，傳統(tǒng)診斷比較費(fèi)事，需要培養(yǎng)（包括肉湯增菌）、鏡下觀察和免疫方法檢測(cè)。對(duì)于一些病原菌如STEC，分子診斷比培養(yǎng)法更有優(yōu)勢(shì)。有人對(duì)13974個(gè)糞便樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了沙門(mén)氏菌之外，其他如空腸彎曲菌、志賀菌等，多重PCR法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更有優(yōu)勢(shì)。有些商品化的平臺(tái)還可自動(dòng)完成核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增、分析，可在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)22種病原體。

PCR結(jié)果可在幾小時(shí)內(nèi)出來(lái)，而培養(yǎng)法要在18h-48h后。但PCR比培養(yǎng)法的價(jià)格要高。對(duì)耐藥菌和耐藥基因同時(shí)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法互補(bǔ)。如果PCR法發(fā)現(xiàn)了耐藥基因，則**通過(guò)培養(yǎng)法檢出耐藥菌，并對(duì)該菌種并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。總之，培養(yǎng)法分離病原體仍然是一種重要方法，它可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，監(jiān)測(cè)感染的爆發(fā)，并將感染原因與最初源頭（如污染的食品）聯(lián)系起來(lái)。

盡管分子方法看上去存在一些優(yōu)勢(shì)，但也仍存在些固有不足。如：對(duì)藥敏試驗(yàn)前需先分離病原菌，這一點(diǎn)PCR法無(wú)法實(shí)現(xiàn)。PCR的另一個(gè)問(wèn)題是存在新基因和基因變異。例如，一個(gè)病原體攜帶一個(gè)耐藥新基因，它可能逃避PCR的檢測(cè)，而它因?yàn)楸磉_(dá)耐藥表型，卻能被顯色培養(yǎng)基給檢出來(lái)。

參考文獻(xiàn)：

Perry JD. 2017. A decade of development of chromogenic culture media

for clinical microbiology in an era of molecular diagnostics. Clin Microbiol Rev. 30:449–479.

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